在保證 ELISA 有效檢測(cè)病原菌的提下，快速、方便也是雙抗夾心 ELISA 的必要條件。雙抗夾心 ELISA 從 加入待測(cè)抗原到得出結(jié)果，檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 共需要5h 左右，而間接 ELISA 則需要 7h(包被 37℃，2h)或 者 17h(包被 4℃guo夜)。本論文篩選出的雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 省去封閉這一步驟。在間接 ELISA 測(cè)定抗原中，封閉一般是必不可少的，因?yàn)榘徊煌瑵舛瓤乖灰欢ǹ梢酝耆采w固相載體表面，如 果不封閉，很可能使隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗 直接被吸附到固相載體上，產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測(cè) 結(jié)果偏高。但是對(duì)于雙抗體夾心 ELISA 來(lái)說(shuō)，在包被 捕獲抗體時(shí)已經(jīng)使固相載體飽和，已經(jīng)沒有多余的吸附 力來(lái)吸附隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗，這都說(shuō)明了雙抗夾心 ELISA 有不需要封閉的可能，通過(guò)正交試驗(yàn) 結(jié)果也證明不封閉可以達(dá)到理想實(shí)驗(yàn)效果，而且還縮短 了整個(gè)檢測(cè)流程和時(shí)間，說(shuō)明只要酶標(biāo)記物是高活性的 并且操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意結(jié)果。雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)法的特異性和靈敏性 抗原抗體的結(jié)合實(shí)際上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空 間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特 異性。但這種特異性并不是的，假使兩種化合物 有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可能出現(xiàn)交叉 反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌 O157:H7 及其他菌株共 10 株作 為抗原用來(lái)檢測(cè)本方法的特異性，結(jié)果顯示大腸桿菌 O157:H7 呈明顯陽(yáng)性反應(yīng)，其余各菌株均呈陰性反應(yīng)， 說(shuō)明本方法對(duì)大腸桿菌 O157:H7 具有明顯的檢測(cè)特異性，而對(duì)所測(cè)定的其它菌株無(wú)交叉反應(yīng)。
本論文所建立的雙抗夾心 ELISA 方法對(duì)純培養(yǎng)的 大腸桿菌 O157:H7 檢出限均105CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 的檢測(cè)限為 10 5 CFU/ml ，趙志晶和劉秀梅[7] 建立的雙抗夾心ELISA 檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7 的檢測(cè)限為 104CFU/ml，兩 者均用單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，而本方法使用 IgY 抗 體與兔多克隆抗體，制備相對(duì)比單克隆抗體簡(jiǎn)單，對(duì)試 劑、成本要求也相對(duì)降低，其效果基本達(dá)到檢測(cè)要求。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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