HePG2細(xì)胞屬人肝腫瘤的恒生細(xì)胞株，L-02細(xì)胞則是人胎肝細(xì)胞株，二者所使用的培養(yǎng)基可以是一樣的，即*常見(jiàn)的DMEM。一般使用低糖的。
  細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank＇s液或PBS配制成0.25%的胰酶。使用前37度預(yù)熱，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩遍后，每個(gè)中號(hào)培養(yǎng)瓶加 0.7ml的胰酶，胰酶的量可根據(jù)自己培養(yǎng)瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶以后，為使酶的活性，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊后放回培養(yǎng)箱中，3分鐘 左右即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。如果在室溫情況下消化，時(shí)間相應(yīng)加長(zhǎng)，可以在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞界限已十分清楚，即已分離為單個(gè)細(xì)胞，且有少量細(xì)胞漂 起，則要終止消化了。

HepG2細(xì)胞株的傳代經(jīng)驗(yàn)：
  首先在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)融合達(dá) 80%，不需要長(zhǎng)滿，就準(zhǔn)備傳代。倒掉舊的培養(yǎng)基，再用已經(jīng)高壓滅菌過(guò)的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培養(yǎng)瓶，加入1毫升已經(jīng)配制好的 0.25%胰蛋白酶－0.02EDTA（0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過(guò)濾，再用一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌，再分裝成1ml的小包裝，剛好 每次用完一個(gè)，避免每次反復(fù)凍存，會(huì)使胰酶的活性下降），加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始變圓收縮，大約1－3 分鐘時(shí)間，必要時(shí)可以吹打幫助細(xì)胞分散，就立即加入培養(yǎng)基中和胰酶，如有EDTA要離心（800rpm,5min），棄上清夜，再加入完全培養(yǎng)基吹 勻，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37度培養(yǎng)24小時(shí)后觀察。

鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70-80%，準(zhǔn)備傳代。常規(guī)開(kāi)紫外照射超凈臺(tái)30分鐘，同時(shí)把含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、PBS放置37 度培養(yǎng)箱中孵育。20分鐘后開(kāi)始傳代。先棄掉舊培養(yǎng)液，加PBS洗一次，然后加0.25%胰酶2ml消化（指10乘10cm大小的培養(yǎng)瓶）細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞變圓，然后將培養(yǎng)瓶放置37度二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3分鐘左右（當(dāng)然時(shí)間是隨機(jī)的，比如：新配的胰酶作用時(shí)間短一些，配制時(shí)間長(zhǎng) 的胰酶作用時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些，當(dāng)然要不斷地鏡下觀察），待細(xì)胞大部分消化下來(lái)（大部分細(xì)胞呈流沙狀脫離瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基終止消 化。反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細(xì)胞，并將已消化下來(lái)的細(xì)胞吹打均勻，然后吸入離心管中1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細(xì)胞彈打均勻， 加新培養(yǎng)基，吹打均勻，分至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶平放，小心移入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察。

胰酶放入37度水浴箱中,千萬(wàn)記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時(shí),我一般把培養(yǎng)瓶口過(guò)一下火,就直接把培養(yǎng)液到去,再 用0.25%的胰酶（不含EDTA）消化.等細(xì)胞變圓,細(xì)胞間空隙加大就直接把培養(yǎng)液到去,不用離心,然后再吹打,雖說(shuō)要輕柔,但很難吹打成單細(xì)胞懸液, 所以稍用力也沒(méi)有關(guān)系.雖然操作不規(guī)范,但節(jié)省時(shí)間,細(xì)胞也沒(méi)有被污染.

AAV-293細(xì)胞較喜歡成團(tuán)生長(zhǎng),比較嬌嫩,怕冷,傳代時(shí)不要一次從二氧化碳培養(yǎng)箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來(lái)傳就可以了,否則細(xì)胞很容易死掉.細(xì)胞在50-60%傳代,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài).
  用 D-Hank＇s液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養(yǎng)瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞.消化過(guò)久,對(duì)細(xì)胞損害 很大,而且成團(tuán)很難吹打成單個(gè)細(xì)胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

其中絕大部分都是貼壁細(xì)胞，具體如：
  （1） A549（肺腺癌）（2）　NCI-H446（小肺細(xì)胞癌）（3）　801（非小肺細(xì)胞癌）（4）　NCI-H460�。ù蠹�(xì)胞肺癌）
  在消化傳代過(guò)程中，步驟基本一致：
  吸 去舊的培養(yǎng)液－＞用Hank’s（1×）清洗一兩次－＞加入一定量的消化液（Trpsin-EDTA）－＞置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超凈臺(tái)－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來(lái)－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞*后再補(bǔ)充加 入一定量新的培養(yǎng)液（RPMI1640 with10 %　FBS）．
  注意：　吹細(xì)胞時(shí)盡量多吹邊角兒，此處細(xì)胞生長(zhǎng)的多．另外吸出細(xì)胞前要混勻．
  另注：消化液的配制方法：
  Trpsin-EDTA（1X）－－0.25% Trpsin with EDTA-4Na
  prepared with 2.5g  Trpsin（1:250） ａnd 0.38g  EDTA-4Na/L in HBSS.

吸棄原培養(yǎng)液－－>PBS洗一兩次－－>加入400ul0.125％胰酶（原代加0.05% EDTA）消化－－>轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，保證整個(gè)盤(pán)面都被trypsin液潤(rùn)過(guò)->吸棄trypsin后37度消化3min－－>以完全培液 （DMEM  10% FCS＋1/1000Biotin 1/1000泛酸鈣－－>吸打（盡量輕緩），1：4-10接種，前后左右搖晃培養(yǎng)皿，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（10%CO2 ,37度）

類(lèi)型：貼壁細(xì)胞
  傳代步驟：
  棄去舊的生長(zhǎng)液－－>用無(wú)鈣鎂水（CMF）沖洗貼壁細(xì)胞數(shù)次（視細(xì)胞瓶的大小,3－－5次）－－>剩少許CMF,滴入 ATV 2－－3滴－－>搖勻細(xì)胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒(méi)個(gè)地方－－>放入37度二氧化碳溫箱中3－－5min消化－－>棄 去ATV,加入生長(zhǎng)液,拍打吸吹下細(xì)胞－－>鏡下觀察－－>分瓶－－>作好記號(hào),放入37度二氧化碳溫箱生長(zhǎng)
  細(xì)胞特點(diǎn):該細(xì)胞生長(zhǎng)力強(qiáng),而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會(huì)變的很老,所以該細(xì)胞傳時(shí)要勤點(diǎn);我感覺(jué)MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、 Vero細(xì)胞等要好傳一些，且不那么容易死亡，所以是我的一個(gè)比較好的選擇！該細(xì)胞適合接種皰疹病毒（如：偽狂犬病毒）！

棄除舊的培養(yǎng)液后－－-用緩沖液沖洗一遍－－－－用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細(xì)胞像沙子一樣脫落－－－－－－-趕緊倒掉胰酶加入含 10%的牛血清培養(yǎng)液終止消化。但目前國(guó)內(nèi)能找到的BHK-21細(xì)胞大部分都有支原體感染，如果是好的BHK-21細(xì)胞能做到1比20的分種率。
  補(bǔ)充一點(diǎn)關(guān)于BHK-21的培養(yǎng),先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會(huì)好一些

BHK－21的經(jīng)驗(yàn)：
  吸出培養(yǎng)基，吸得越干凈越好，緩沖液洗滌2-3遍，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培養(yǎng)箱消化。如果細(xì)胞長(zhǎng)得太老，可以先加入1ml胰酶在細(xì)胞 表面浸潤(rùn)一下就吸出來(lái)，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前預(yù)熱到37度。由于胰酶平時(shí)保存在4度，反復(fù)預(yù)熱對(duì)胰酶的活性不好，我的經(jīng)驗(yàn)是將胰酶 進(jìn)行分裝，盡可能避免胰酶反復(fù)冷卻加熱。消化時(shí)間的選擇要根據(jù)實(shí)際情況決定，BHK－21還是比較好消化的，3－8min應(yīng)該足夠了，消化時(shí)間太長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞不利�？梢栽陲@微鏡下觀察消化情況，必要時(shí)可以拍打培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞分散，消化結(jié)束后直接加入培養(yǎng)基即可，胰酶會(huì)被血清滅活。一般在T－25瓶中留 7－8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)。在90％單層細(xì)胞時(shí)，1：4傳代2天后可長(zhǎng)滿。如果使用的培養(yǎng)基偏堿先放在CO2培養(yǎng)箱中平衡。細(xì)胞生長(zhǎng)中注意觀察培養(yǎng)基顏色 （加入酚紅作指示劑），如出現(xiàn)偏黃表明細(xì)胞代謝產(chǎn)酸較多，此時(shí)如細(xì)胞未長(zhǎng)滿應(yīng)更換部分或全部培養(yǎng)基以確保細(xì)胞狀態(tài)不受影響。

細(xì)胞：皮膚成纖維細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的。THP-1細(xì)胞是懸浮的。
  由于我們實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間也不是很長(zhǎng)，所以也只能說(shuō)說(shuō)自己平時(shí)的操作了。
  先說(shuō)皮膚成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底，也就是細(xì)胞與細(xì)胞之間沒(méi)有間隙時(shí)，就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗兩遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后靜置兩分鐘左右，是能在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞之間出現(xiàn)間 隙且有一部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形后即可。吸去胰酶，加入含血清培養(yǎng)液，搖晃瓶子使培養(yǎng)液覆蓋瓶底就行了。因?yàn)檠�清可以終止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫 落。再分瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液。
  THP-1細(xì)胞的傳代就比較簡(jiǎn)單了�？梢杂袃煞N傳代方法。如果鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)很好，沒(méi)有其它雜質(zhì)即細(xì)胞裂解物之類(lèi)的，就 可以采用直接傳代法。傳代前將細(xì)胞培養(yǎng)瓶直立一個(gè)半小時(shí)使細(xì)胞自然下沉。吸棄上層少量培養(yǎng)液約三分，將余下的培養(yǎng)液分成兩瓶，再分別補(bǔ)加培養(yǎng)液即可。 如果鏡下觀察覺(jué)得培養(yǎng)液中有雜質(zhì)即可采用離心傳代法。如果細(xì)胞數(shù)目較多可以低速離心約600轉(zhuǎn)離心六分鐘，細(xì)胞可以沉淀下來(lái)而且可以去除細(xì)胞碎片之類(lèi)的雜 質(zhì)。如果覺(jué)得細(xì)胞數(shù)目不多比較寶貴，那就提高轉(zhuǎn)速可以1000轉(zhuǎn)離心六分鐘，這樣細(xì)胞損失很少但可能也有些雜質(zhì)會(huì)一起沉淀下來(lái)。離心后去除上清液，加入新 的培養(yǎng)液吹打渾勻即可分瓶傳代了。
  目前的方法就這些，希望對(duì)新手有所幫助

我養(yǎng)的細(xì)胞都是乳腺癌細(xì)胞，就是以下幾種，
  1、 MCF-7：是一種很好養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能長(zhǎng)得很好。一般兩到三天傳一代。傳代也很常規(guī)。吸出培養(yǎng)基，加入0.25％的胰酶1ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰酶流遍瓶壁，以 去除殘余的培養(yǎng)基。再加入2ml胰酶（25ml培養(yǎng)瓶）靜置消化2－5min，待細(xì)胞縮起變圓，將胰酶吸出加入培養(yǎng)基3ml吹打成單細(xì)胞懸液分瓶即可。我 一般都不用緩沖液沖洗，而直接用胰酶沖洗一下以去除剩余血清的作用，感覺(jué)效果還不錯(cuò)。因?yàn)镸CF-7消化較快，一般不放到培養(yǎng)箱中消化，以免消化太過(guò)。需 要注意的是MCF-7生長(zhǎng)較快如不及時(shí)傳代可出現(xiàn)整瓶細(xì)胞浮起，一般都來(lái)不及搶救。
  
  2、T47D：也是一種人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培養(yǎng)方法與MCF-7差不多，但這種細(xì)胞傳代時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)極難養(yǎng)。我曾養(yǎng)過(guò)一株新從美國(guó)購(gòu)置的，兩三天傳一代，長(zhǎng)得很旺。后又從國(guó)內(nèi)購(gòu)買(mǎi)一株時(shí)間較長(zhǎng)的，要七天傳一代，而且很嬌氣。
  
  3、MA891 鼠乳腺癌細(xì)胞：這種細(xì)胞比較特殊的是很難消化，容易消化成一團(tuán)一團(tuán)的，如果胰酶的量比常用的多三分充分預(yù)熱并放入培養(yǎng)箱中消化就會(huì)好的多。傳到15－20代細(xì)胞就易長(zhǎng)成團(tuán)，從此生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)改變，需要復(fù)蘇重養(yǎng)。

首先要把0.25%的胰酶和培養(yǎng)液在37度水浴20~30分鐘（預(yù)熱）.從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)的細(xì)胞瓶（一般我是讓它長(zhǎng)到90%幾再傳代的）,吸去培養(yǎng)液, 可用PBS洗兩遍.也可不洗.加入適量0.25%胰酶消化（試瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了）,讓它都浸濕細(xì)胞就可以吸去了.等個(gè)三 十秒就在手上拍打,不要太用勁.就可以看到細(xì)胞脫落了,再加入3毫升左右的培養(yǎng)液吹打（這時(shí)加的培養(yǎng)液不要太多,否則難吹打成單個(gè)細(xì)胞!）,制成細(xì)胞懸 液,再傳至消毒的培養(yǎng)瓶中（我一般是1傳三,三天后又可以傳代了）再加入適量培養(yǎng)液（如250毫升瓶中加入12~14毫升）.再放置在37度5%CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng).
  在操作過(guò)程中要有酒精燈的,瓶口,鑷子等可在火上過(guò)一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.無(wú)菌觀念要強(qiáng)!

80%-90%confluency, 吸棄原培養(yǎng)液－－>PBS洗一次－－>加入400ul0.125％胰酶（10cm）－－>轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)盤(pán)，保證整個(gè)盤(pán)面都被trypsin 液潤(rùn)過(guò)->37度消化5-10min－－>以完全培液（RPMI1640 10% FBS－－>吸打,1：5接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤(pán)，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%CO2 ,37度，24h一個(gè)周期

是一種貼壁細(xì)胞，貼壁后繁殖迅速，約3－4天傳代。切記：不要等到細(xì)胞貼的太滿，約70－80％即可傳代（細(xì)胞傳代時(shí)不能長(zhǎng)的太滿,70%-80%就可以 傳了BSZLY2003）。否則細(xì)胞容易聚團(tuán)，再想將其打散很不容易，并且打散后細(xì)胞的狀態(tài)也不好了。我用的消化液是EDTA，新配的感覺(jué)特好用，胰酶也 用過(guò)，但不如EDTA好用。以下傳代方法同樓上各位朋友。
  另外還有一點(diǎn)建議：細(xì)胞傳代之前用75％酒精棉球擦一擦手。細(xì)胞培養(yǎng)瓶打開(kāi)前也要擦一下，可以降低污染的幾率。

是小鼠骨髓瘤細(xì)胞株，貼壁生長(zhǎng)，科室給學(xué)生開(kāi)實(shí)驗(yàn)就用此細(xì)胞，所用培養(yǎng)基為1640，用小牛血清，濃度15%生長(zhǎng)較好。培養(yǎng)孵箱為37度，5%的CO2。
  開(kāi)始將復(fù)蘇的細(xì)胞傳到小培養(yǎng)瓶（如25ml），由于細(xì)胞分泌各種因子及細(xì)胞間的相互作用，因此生長(zhǎng)較快，1-2天就可進(jìn)行傳代（當(dāng)然要達(dá)到80-90%的融合）。
  消化采用0.25%的胰酶，在顯微鏡下觀察，看細(xì)胞形態(tài)變圓，而且細(xì)胞間界限明顯后，或有極少數(shù)細(xì)胞漂浮起來(lái)就可終止消化。
  吹打時(shí)，動(dòng)作要輕、快，而且吹管中要吸滿液體，這樣就不會(huì)產(chǎn)生氣泡，吹打按一定的順序進(jìn)行，將瓶子徹底吹打，尤其是邊緣和角落。
  傳代，先將此瓶細(xì)胞只傳到一個(gè)大瓶中，以保證細(xì)胞的數(shù)量，小瓶也可保留，繼續(xù)培養(yǎng)。這樣3-4天又可進(jìn)行傳代。

本人的細(xì)胞株購(gòu)自武漢中國(guó)典藏物培養(yǎng)中心（美國(guó)ATCC株亞型），培養(yǎng)基是MEM， 10％的小牛血清（購(gòu)自杭州四季青公司）。傳代要看細(xì)胞數(shù)的多少，一般來(lái)說(shuō)10％的細(xì)胞，要5天左右，如果90％融合的細(xì)胞一傳2，3天子代細(xì)胞即可傳 代。傳代：偶用的是25ml培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)基，6mlpbs沖洗3次，加入0.25％的胰酶2－3ml，胰酶均勻蓋滿瓶壁，消化2－5min左右（可以 同時(shí)振搖），細(xì)胞縮起變圓，浮起，加入培養(yǎng)基2－3ml，不用太精確，吹打成單細(xì)胞懸液分瓶即可。室溫下消化即可，因?yàn)槭浅衫w維細(xì)胞，較為耐受胰酶，消化 時(shí)間稍長(zhǎng)亦可，要注意mcf-7細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞，生長(zhǎng)規(guī)律性差，很容易不均勻，要注意吹打的充分性

棄培液－－>以D-Hanks＇液洗兩次－－>0.05％胰酶消化－－>鏡下觀察細(xì)胞變圓（約5分鐘）－－>以完全培液（DMEM 10% FCS）終止反應(yīng)－－>吹打，1:3 - 1:4接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
  該細(xì)胞系生長(zhǎng)速度很快，所以采用1:3 - 1:4接種，而且換液間隔不要超過(guò)48h，否則細(xì)胞容易脫落下來(lái)。

如Molt－4,Hl－60等：這些細(xì)胞的特點(diǎn)是懸浮生長(zhǎng)，傳代方便，而且適應(yīng)能力強(qiáng)——————好養(yǎng)！
  當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到約2—8×10（6）后，即可認(rèn)為進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)傳代好，一般控制在2－5×10（6）之間，此時(shí)狀態(tài)。

直接在細(xì)胞懸液中加入一定比例的培養(yǎng)基。比例是根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排而定，此細(xì)胞一般24小時(shí)左右可以增長(zhǎng)一倍數(shù)量，因此，如果現(xiàn)在的濃度為4，您明天要實(shí)驗(yàn)，則可1：1傳，————2×10（6）。明天同一時(shí)間大概就是4左右。

生長(zhǎng)迅速，必須每天觀察，因此如果明天您要4×10（6），今天為4，就必須以1：2～3的傳。否則明天就已經(jīng)因濃度太大而不易實(shí)驗(yàn)。
  因是懸浮細(xì)胞，所以觀察時(shí)以大小，圓不圓，顆粒多少，成團(tuán)情況，培養(yǎng)基顏色來(lái)觀察

貼壁細(xì)胞，以25ml小方瓶為例，培養(yǎng)液用的是MEM。
  MEM的配制：10%小牛血清，1%雙抗，3%谷氨酰胺，1~1.5%NaHCO3.
  傳代方法：
  1.倒掉培養(yǎng)液，如果細(xì)胞臟的話可用PBS洗兩次，否則不用。
  2.胰酶0.25%2ml消化1~3分鐘，容易消化.
  3.倒掉胰酶，加MEM9~12ml,將貼壁細(xì)胞搖至懸浮，并用吸管吹勻，一傳三或一傳四。
  4.放置37度，5%CO2孵箱

是一種懸浮細(xì)胞：
  1、培養(yǎng)液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，慶大霉素100IU／ml；
  2、培養(yǎng)條件：5％CO2，37度，30％濕度；
  3、細(xì)胞復(fù)蘇：要快速將凍存管放入37度水中，不斷輕輕搖晃，直到細(xì)胞完全溶解，加入10ml左右的培養(yǎng)液，800～1000rpm，10分鐘離心，之后倒掉液體，加入新的培養(yǎng)基就可以進(jìn)行培養(yǎng)了；
  4、細(xì)胞培養(yǎng)：起初進(jìn)行傳代時(shí)由于細(xì)胞剛剛復(fù)蘇，長(zhǎng)得比較慢，所以可以3～4天傳一代，傳過(guò)兩代后，一般2～3天傳一代，每次傳代后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，在傳過(guò)幾代合適的時(shí)候可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
  5、細(xì)胞凍存：1000rpm離心后，棄去液體，加入含有15％DMSO的凍存液，按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－80℃ 1小時(shí)）→液氮。
  6、我在做細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一些小經(jīng)驗(yàn)：
  （1）細(xì)胞培養(yǎng)箱在每使用1個(gè)月用酒精擦洗一次，這樣可以減少污染；
  （2）雖然說(shuō)加樣器放在紫外下照射會(huì)不準(zhǔn)，但我們還是丟了一把1ml的加樣器在超凈臺(tái)，沒(méi)有拿出來(lái)過(guò)，我想這樣也許會(huì)減少污染；
  （3）小牛血清我們用的是國(guó)產(chǎn)的，所以在一開(kāi)始的時(shí)候加了15％的小牛血清，但細(xì)胞總是長(zhǎng)不好，后來(lái)摸索條件，把小牛血清的量調(diào)到了20％，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛；
  （4）HEPES雖然貴點(diǎn)，但加上去后細(xì)胞會(huì)長(zhǎng)的不錯(cuò)；
  （5）在超凈臺(tái)操作前要用0.1％的新潔爾滅或75%酒精擦手

細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，細(xì)胞無(wú)污染、退縮，等其長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約70%-80%時(shí)即可進(jìn)行傳代操作，具體步驟如下：
  1. 打開(kāi)瓶蓋，棄上清,2.D-HANK‘S夜（以50ml培養(yǎng)瓶為例，下同）2吸管清洗后棄之；3.加0.25%胰酶2吸管；4.輕搖晃后置入37度溫 箱；5.3-5分鐘后置顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)退縮，變圓；6.吸去胰酶，加含10黃的RPMI1640 3吸管；7.用洗管吹打，見(jiàn)細(xì)胞脫落，培養(yǎng)液變混，即可吸出加到新的培養(yǎng)瓶中。
  注意事項(xiàng)：若胰酶消化超過(guò)時(shí)間，見(jiàn)細(xì)胞已漂浮，切不可直接倒去上清，可直接加等量的含10黃的RPMI1640，吹打后加到離心管中離心5分鐘，再棄上清，加入培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。

小鼠成纖維細(xì)胞。消化過(guò)程：倒掉培養(yǎng)基——向培養(yǎng)瓶中加入少量37度預(yù)熱的0.25%胰酶，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶使胰酶浸過(guò)瓶底，倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶，加 入量以能覆蓋細(xì)胞為宜，1分鐘后倒掉胰酶——將培養(yǎng)瓶置于37度孵箱中——顯微鏡下觀察，細(xì)胞開(kāi)始變形時(shí)以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成 單細(xì)胞懸液，1:2~1:3接種，繼續(xù)培養(yǎng)。
  SKOV3細(xì)胞傳代方法：
  自CO2培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶－>超凈工作臺(tái)中,以吸管輕輕吹打 有細(xì)胞的瓶壁，去除生長(zhǎng)不好的細(xì)胞－－>棄去培養(yǎng)液－－>加0.04%&<46;  EDTA數(shù)滴 （用0.02%的EDTA不易消化掉） ，浸過(guò)細(xì)胞－－>置37℃培養(yǎng)箱10min&<46;左右－－>取出，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓回縮，但又未自瓶壁脫落 －－&<46;>超凈工作臺(tái)中棄去EDTA－>加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基 －－&<46;>吸管吹打后，1:2或1:3接種。&<46;

通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在細(xì)胞約80%匯合時(shí)傳代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶（前提是用10%以上濃度的血清 DMEM培養(yǎng)液）加上胰酶直接拍打至細(xì)胞脫落加入少許培養(yǎng)液中和后分瓶然后補(bǔ)加培養(yǎng)液 5%CO2孵箱 37度培養(yǎng)效果不錯(cuò)。

293 貼壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下來(lái)，但這樣下來(lái)的細(xì)胞容易聚成團(tuán)，傳代后形態(tài)不大好看�？梢韵鹊沟襞囵B(yǎng)液，以D-HANK‘S液輕輕沖洗，再加 0.6ml 0.25%胰酶/0.01鞹A，輕輕潤(rùn)濕細(xì)胞后即可棄去，置于鏡下觀察，很快即可見(jiàn)細(xì)胞變圓，加入適量完全培養(yǎng)基終止，輕輕吹打即可。這樣細(xì)胞既不會(huì)消化 過(guò)頭，又極盡吹散。

貼壁細(xì)胞：在消化傳代過(guò)程中，步驟如下：
  用 滴管吸盡舊的培養(yǎng)液－＞用培養(yǎng)基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已預(yù)熱）-＞顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超靜臺(tái)－＞用滴管吸盡酶液－＞加入一定 量的含血清的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來(lái)－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞*后再補(bǔ)充加入一定量新的培養(yǎng)液， 放入培養(yǎng)箱。
  可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。

以50ml培養(yǎng)瓶為例
  1、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿瓶底80％時(shí)，膠頭滴管移去培養(yǎng)液，可輕輕吹打，移液時(shí)不留培養(yǎng)液殘余
  2、加0.25％胰酶1ml消化37℃約2min，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞基本圓形脫落，加含血清培養(yǎng)液2ml中止消化，反復(fù)混懸
  3、移入離心管，1200g，5min
  4、棄去上清，加入新培養(yǎng)液5ml，再次吹打混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶，鏡下可見(jiàn)散在分布圓形細(xì)胞
  5、入37℃5％CO2孵箱，半天即可再貼壁。

將Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)于高葡萄糖（的DMEM培養(yǎng)基中（ 1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine）, 培養(yǎng)液含青霉素（ penicillin）10,000U/ml-鏈霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS））,長(zhǎng)于T-75組織培養(yǎng)曲頸瓶中,通入5%CO2（相對(duì)濕度90%）,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)2～3天更換一次,當(dāng)細(xì)胞達(dá) 到90%融合后，以不含鈣,鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后與胰酶（0.25%）—EDTA（1mM）于37℃一起孵育至分離（約5～10分鐘）。 吹打細(xì)胞使之脫落，置離心管中1000rmp離心5分鐘。細(xì)胞重新懸浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培養(yǎng)瓶中。即完成傳 代。

37度，5％CO2培養(yǎng)箱。
  消化前所 用物品75％酒精擦拭后放到超凈臺(tái)上，紫外照射30min，同時(shí)胰酶和1640培養(yǎng)液（10％小牛血清，杭州四季青）75％酒精擦拭后放入37度培養(yǎng)箱平 衡，進(jìn)無(wú)菌室開(kāi)始傳代時(shí)取出。來(lái)蘇水托地，整個(gè)房間紫外消毒30min。開(kāi)風(fēng)淋30min（時(shí)間寧長(zhǎng)勿短啊，有一次弄得我的臉暴皮！半個(gè)月才緩過(guò)來(lái)）。 Bel7402通常都是棄培養(yǎng)液（我通常是倒，覺(jué)得用吸管次數(shù)多會(huì)增加污染的機(jī)會(huì)，而我老師意見(jiàn)正好相反，郁悶�。�，加入少量胰酶清洗，棄去后，加入胰酶 2－3ml，培養(yǎng)箱內(nèi)放置3min左右，取出，加入培養(yǎng)液中和胰酶，輕輕吹打即可。
  ECV－304培養(yǎng)條件同時(shí)。操作的時(shí)候步驟基本相同，只是加入胰酶消化的時(shí)間比Bel-7402稍微長(zhǎng)1－2min。

包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，幾種細(xì)胞的特性不完全一樣，但是我的傳代的步驟是基本一致的：細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)傳代， 先倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)先加好雙抗的生理鹽水或PBS 5-10ml（100ml培養(yǎng)瓶）后輕輕搖晃數(shù)次后倒掉，加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其分布均勻（這一點(diǎn)很重要，一定要注意工作臺(tái)是否平 整，否則容易造成胰酶分布不均勻而細(xì)胞消化不同步），待細(xì)胞間隙變大時(shí)終止消化，加含10%血清的培養(yǎng)液（我用的是1640）4ml輕柔吹打，再按照需傳 代的比例（1：2或1：3）補(bǔ)足培養(yǎng)液后分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。若細(xì)胞碎片較多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培養(yǎng)液吹打后500rpm離心 5min，再用培養(yǎng)液重懸分瓶。消化所需的具體時(shí)間依細(xì)胞的種類(lèi)和狀態(tài)而定，也和細(xì)胞的匯合程度有關(guān)，一般是80%匯合時(shí)*容易消化，若細(xì)胞長(zhǎng)得太滿，消 化時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)，必要時(shí)可以將培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱內(nèi)消化。另外，一次性培養(yǎng)瓶要比玻璃培養(yǎng)瓶所需的消化時(shí)間稍長(zhǎng)。
  胰腺癌細(xì)胞我所養(yǎng)的是CAP，感 覺(jué)不太好伺候，尤其是傳代時(shí)很困難。我一般是在倒掉培養(yǎng)液后，加生理鹽水或PBS沖洗，而后加一次胰酶作用3-5分鐘，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶 繼續(xù)消化，這樣加兩次的效果好一些，但是吹打的時(shí)候還是很困難，總感覺(jué)細(xì)胞的貼壁能力太強(qiáng)了，明明看見(jiàn)細(xì)胞已經(jīng)變圓了，可就是吹不下來(lái)�，F(xiàn)在想想可能在胰 酶中加EDTA會(huì)好一些。