在293 細(xì)胞中大量擴(kuò)增腺病毒

一旦重組病毒已被純化和鑒定，即可在293 細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增。本手冊提供了遞增培養(yǎng)規(guī)模和腺病毒感染周期的基本方法，按這一方法*終得到的病毒量約為3×10¹¹～3×10¹²。由于一個(gè)細(xì)胞中所含的病毒顆粒為1000～10000，因此1L 培養(yǎng)細(xì)胞可得到約5×10¹² 病毒顆粒。如果要把病毒用氯化銫梯度離心純化，則必須至少3×10⁸ 的細(xì)胞，這樣才能正確分辨出病毒帶。對于蛋白表達(dá)，則根據(jù)需要可在任何一步擴(kuò)增步驟中停止，離心沉淀細(xì)胞后按照適當(dāng)?shù)牟僮鞣椒ㄟM(jìn)行蛋白抽提（根據(jù)蛋白類型的不同抽提上清或細(xì)胞沉淀）。為優(yōu)化時(shí)間進(jìn)程，每個(gè)感染周期必須與下一次細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)同步。如果由于各種原因不能同步，則必須將病毒凍存，直至下一次細(xì)胞培養(yǎng)開始后再融化病毒。注意每次擴(kuò)增都將會剩下一些病毒，這些病毒先不必丟棄，以便下一步擴(kuò)增失敗時(shí)備用。每次擴(kuò)增都用代的病毒顆粒，這樣產(chǎn)生突變型病毒的可能性會大大降低。

操作步驟：

1 在100mm 培養(yǎng)皿或75cm² 培養(yǎng)瓶中加入10ml DMEM5%培養(yǎng)5×10⁶ 293 細(xì)胞。

2 取0.5ul 首次擴(kuò)增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混勻，這樣稀釋得到的MOI 值約為5。

3 移去培養(yǎng)液，小心加入病毒混合液，切勿破壞細(xì)胞單層，十字形慢慢晃動3 次，37℃ CO2 孵箱中培養(yǎng)90 分鐘。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培養(yǎng)72 小時(shí)，這時(shí)在10ml 溶液中大約有5×10⁹～5×10¹⁰ 個(gè)病毒顆粒，進(jìn)行MOI 測定以估計(jì)病毒顆粒。

注：如果此時(shí)得到的病毒量已足夠，可立即進(jìn)行病毒滴度測定。收集細(xì)胞，600×g 離心5 分鐘沉淀細(xì)胞，去上清后加入*小體積（一般為原始體積的1/10 即1ml）病毒保存溶液重懸細(xì)胞。-20⁰C /37⁰C 凍融3 次，臺式離心機(jī)上以速率離心去除細(xì)胞碎片，收集上清，然后進(jìn)行病毒滴定。

1  -20℃/37℃凍融3 次。

2轉(zhuǎn)入15ml 無菌離心管中，臺式離心機(jī)上以速率離心10 分鐘，收集上清凍存于-20 ℃或-80 ℃。

3  3 個(gè)175cm² 培養(yǎng)瓶中各加入10⁷ 293 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

4  將3ml 細(xì)胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混勻。移去細(xì)胞培養(yǎng)液，每瓶小心加入5ml 混合液，十字形慢慢晃動混勻3 次，37⁰C 5%CO2 孵箱中培養(yǎng)90 分鐘。此時(shí)MOI 值約為25。

5 加入DMEM5%至30ml。

6 再培養(yǎng)48～72 小時(shí)。此時(shí)10ml 培養(yǎng)液病毒量約為3×10¹⁰～3×10¹¹。若需要，進(jìn)行MOI 測定以估計(jì)病毒滴度。

注：如果此時(shí)病毒量已可以滿足實(shí)驗(yàn)所需，則可立即進(jìn)入病毒滴定步驟。600×g 離心5 分鐘收集細(xì)胞，棄上清，加入1/10 原始體積的溶液重懸細(xì)胞。-20⁰C /37⁰C 凍融3 次，臺式離心機(jī)上以速率沉淀細(xì)胞碎片，收集上清，進(jìn)行病毒滴定。

12. 移入50ml 離心管中，臺式離心機(jī)上速率離心10 分鐘，取出上清保存。

13. 30 瓶175 cm2 培養(yǎng)瓶中每瓶各加入10⁷ 293 細(xì)胞。

14. 將45ml 細(xì)胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混勻，從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液，加入5ml 混合液感染細(xì)胞，十字形緩慢晃動3 次混勻，370C 培養(yǎng)90 分鐘。此時(shí)MOI 值約為25。

15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16. 再培養(yǎng)48-72 小時(shí)，此時(shí)約有3×10¹¹～3×10¹² 個(gè)病毒。若需要，進(jìn)行MOI 測定估計(jì)病毒滴度。

如果要收集病毒顆粒，先收集被感染細(xì)胞，然后重懸在5ml DMEM5%中。-20⁰C /37⁰C 凍融3 次，離心沉淀細(xì)胞碎片。此時(shí)5ml DMEM5%中3×10¹¹～3×10¹² 個(gè)病毒顆粒，濃度為6×10¹⁰～6×10¹¹vp/ml。然后測定病毒滴度，或者用標(biāo)準(zhǔn)的氯化銫密度梯度離心法純化病毒。

在109 細(xì)胞中擴(kuò)增病毒可獲得大量病毒保存液，而在1010 細(xì)胞中擴(kuò)增則有一定技術(shù)性。切勿將擴(kuò)增后的病毒保存液再用來感染細(xì)胞，因這會大大增加RCA 產(chǎn)生量。有時(shí)不得不使用純化空斑以可能降低RCA 產(chǎn)量。如果已沒有純化的空斑，那么就不得不重新空斑純化重組病毒，鑒定克隆后再進(jìn)行擴(kuò)增。如果需要大于擴(kuò)增4 輪后的病毒量，注意請用早期的病毒作為擴(kuò)增源。比如，用第2 代病毒產(chǎn)生第3 代病毒。如果沒有第2 代病毒，那么必須用第1 代病毒來產(chǎn)生新的第2 代病毒。按這個(gè)原則進(jìn)行擴(kuò)增可使RCA 水平盡可能低。

如果用于表達(dá)蛋白，則可以收集細(xì)胞后根據(jù)蛋白特點(diǎn)選擇適當(dāng)方法抽提蛋白。細(xì)胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白，建議在小規(guī)模擴(kuò)增后先測定感染后抽提蛋白的*佳時(shí)間，然后再大量擴(kuò)增蛋白。

腺病毒擴(kuò)增