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公司新聞

恒遠：磷酸鈣轉染法

閱讀次數(shù)：1344 發(fā)布時間：2012/9/5 9:14:11

磷酸鈣轉染法
材料：
質粒DNA
指數(shù)生長的真核細胞
2 M CaCl2
2×HBS （pH 7.05）
配方:
2×HBS （pH7.05）：900 ml 超純水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214
g，Glucose 2.4 g 和HEPES 10 g，調pH 至7.05，定容至1 升，過濾（0.2 μm 濾
膜）后儲存于4℃?zhèn)溆谩?br />方法：
1. 細胞分盤：通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基以1×105 至4×105
細胞/cm2 的密度平鋪細胞于60 mm 組織培養(yǎng)皿上（根據(jù)實驗需要選擇培養(yǎng)皿，
使細胞貼壁后所占面積達到培養(yǎng)皿總面積的40－70％）。將細胞置于含5％
CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前2 h 換
液（用4 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）。
注：為得到較高的轉染效率，盡量使用指數(shù)生長的細胞，轉染時細胞的密度不
超過80％。
2. 制備磷酸鈣－DNA 沉淀：以60 mm 組織培養(yǎng)皿用500 μl 反應總體積為例。在
滅菌水中加入質粒DNA（總量4－10 μg 為佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三
者總體積達到250 μl，混勻。將等體積2×HBS 鹽溶液逐滴加入，同時輕彈管
壁，使每滴加入后及時混勻。靜置2 min 后，立即將這500 μl 的磷酸鈣－DNA
懸液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻。
注：可以觀察到滴入的部位培養(yǎng)基瞬間會出現(xiàn)渾濁的橘黃色，應盡快將其混勻，
避免形成過大的顆粒，影響轉染效率。
3．若轉染的細胞不用轉染促進劑處理，則置于含5％ CO2 的37℃溫箱孵育。8 h
后吸去培養(yǎng)基與DNA 沉淀，加入5 ml 37℃預熱的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細胞放
置溫箱孵育，16-40 h 觀察其轉染效率。
參考：分子克隆實驗指南第三版（p1284～1285）

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