這年頭，做科研的不會做ELISA實驗，都不好意思出門。做ELISA實驗容易，想要做好ELISA實驗還是有點難度的！求助，做ELISA實驗老是失敗怎么辦？天恒遠生物小編為大家總結(jié)ELISA實驗經(jīng)驗，讓大家避免掉入“坑”里，以后的ELISA實驗必定是一路綠燈！
酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA或ELASA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。
一、ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。ELISA實驗中有三種必要的試劑：
① 固相的抗原或抗體（用于結(jié)合到固相載體上）
② 標記的抗原或抗體（標記物）
③ 作用的底物（顯色劑，用于顯色）
二、ELISA實驗成功七要素：
①成功采集到樣品
②樣品保存妥當
③成功復(fù)溫樣品，確保沒有降解
④試劑盒質(zhì)量沒問題
⑤成功做出標準曲線
⑥操作過程沒有出現(xiàn)差錯，編號沒有混亂
⑦顯色之后顏色明顯，且在檢測范圍之內(nèi)
三、四種常見ELISA方法
1.直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上，然后用酶標抗體直檢測抗原。
相較于其它類型的ELISA實驗，直接ELISA實驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與ELISA板結(jié)合，實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大，降低了測定的靈敏度。
2.間接ELISA
先將抗原結(jié)合到ELISA板上，隨后分兩步進行檢測：先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。
與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標記抗體，更經(jīng)濟。間接ELISA還提供了更大的靈活性，因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標二抗直接與抗原結(jié)合），可能會增加背景，同時與直接ELISA相比，間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟，實驗周期延長。
3.夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中，然后加入樣品，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標抗體，則可稱為直接夾心ELISA；如果檢測抗體不帶有標記，則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。
夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍；同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進行檢測，靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高，如果沒有標準化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體，則需要進行配對抗體定制并進行優(yōu)化，因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。
4.競爭ELISA法
預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標記的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標抗體；如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標抗體，后加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。
競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和一性較差的問題。
四、ELISA常見問題與解決方法
1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果
① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。
② 酶標板洗滌不徹底——洗板先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。
③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當濃度。
2．酶標板整體背景高
① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。
② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當稀釋。
③ 反應(yīng)時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)，適當縮短顯色時間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。
3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差
① 樣品數(shù)量不整齊，加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與次接近。
② 加樣量不一致——樣品稀釋應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。
③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。
4. 吸光值偏高或偏低
① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。
② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的適用量。
③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。
④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在適宜條件下進行孵育（一般37℃孵育1h）。
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