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酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題解析

點(diǎn)擊次數(shù)：15171 發(fā)布時(shí)間：2021/3/5 9:19:06

酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題因靈敏度高，特異性強(qiáng)在生物科研上得到了廣泛的認(rèn)可，但對(duì)初學(xué)者而言，如不注意實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，可能會(huì)對(duì)終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響，比如實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)白板，顯色弱靈敏度低，花板無(wú)梯度背景高等現(xiàn)象。下面對(duì)以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行解析。

1.白板現(xiàn)象

在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中所有孔的顏色均為無(wú)色，即無(wú)信號(hào)呈現(xiàn)。

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

試劑已過(guò)保質(zhì)期，不同批次稀釋液交叉使用。

錯(cuò)加漏加檢測(cè)A，檢測(cè)B或者底物溶液TMB。

洗板或者加樣過(guò)程中，酶標(biāo)記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。

配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。

洗滌液是濃縮型的，沒(méi)有按比例進(jìn)行稀釋。

酶標(biāo)記物的活性和效價(jià)比較低。

溶液的PH值不正確，般稀釋液的PH值應(yīng)保持在7.2-7.4。

2.顯色弱靈敏度低

在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號(hào)呈現(xiàn)。

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

產(chǎn)品過(guò)有效期，試劑沒(méi)有按規(guī)定進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４妗?/span>

試劑，標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品在使用沒(méi)有平衡到室溫。

少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當(dāng)。

洗板或者加樣過(guò)程中，酶標(biāo)物受污染失活。

孵育時(shí)間和孵育溫度未達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗板次數(shù)過(guò)多，洗板沖擊力過(guò)大，洗板浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

底物溶液TMB顯色時(shí)間太短。

3.花板無(wú)梯度背景高

在完成所有實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中的孔有顏色但沒(méi)有梯度，背景也可能較高，。

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實(shí)驗(yàn)溶液已經(jīng)變藍(lán)。

孵育溫度過(guò)高或者孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)生了較強(qiáng)的非特異性吸附。

沒(méi)有按說(shuō)明書(shū)要求洗板，特別是洗板時(shí)洗滌液的量少加了。

加樣時(shí)沒(méi)有換槍頭造成交叉污染。

花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測(cè)抗體，封閉不足導(dǎo)致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分，包被板子的問(wèn)題。

綜上所述：在ELISA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下問(wèn)題：

1.在實(shí)驗(yàn)應(yīng)該按相關(guān)要求將實(shí)驗(yàn)試劑平衡至室溫。

2.包被抗體和檢測(cè)抗體應(yīng)該是有高活性的且都針對(duì)同抗原。

3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。

4.各試劑在使用應(yīng)充分混勻，以保證試劑的均性和準(zhǔn)確性。

5.嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)試劑。

6.洗板次數(shù)，洗板液的量，洗板液浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短，洗板的力度都是應(yīng)該注意的問(wèn)題。

7.相關(guān)濃縮液應(yīng)按要求稀釋到相應(yīng)比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之間。

8.在終止反應(yīng)時(shí)盡量避免微孔中存有氣泡。

9.終止反應(yīng)完成后應(yīng)該在2min內(nèi)完成酶標(biāo)儀讀數(shù)。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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