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技術(shù)文章

正確配制MTT試劑的方法,你知道嗎?

點擊次數(shù)：14925 發(fā)布時間：2020/9/9 9:58:23

一、MTT試劑主要有兩個用途：

1．藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培育的細(xì)胞毒性的測定；

2．細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。

二、MTT試劑原理：

檢查原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT試劑還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。

三、配制方法——懸浮細(xì)胞

1.收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640（無血清）培育基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培育液稀釋（儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找zui佳稀釋度，1:10-1:20）；③需檢查物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul參入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml 1640）。

2.置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3.每孔參入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培育4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培育4 h后可跳過步驟4，直接酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）

4.離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔參入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。

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