IMD對(duì)缺血-再灌注心肌保護(hù)ATP敏感性鉀通道的作用研究
衛(wèi)雷 成尚霖 馬捷

【摘要】目的 觀察心肌缺血期處理后在體大鼠心肌缺血- 再灌注損傷中中介素(Intermedin IMD) 參與情況下的保護(hù)機(jī)制 ； 研究IMD對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是否途經(jīng)ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)，為探討心肌保護(hù)機(jī)制提供臨床思路。方法 選取標(biāo)準(zhǔn)SD 大鼠45 只，隨機(jī)分為缺血再灌注組(I/R 組)、IMD 治療組(IMD 組)、格列本脲+IMD 治療組(Gli+IMD 組)，每組15 只。各組分別于再灌注末期分別抽取動(dòng)脈血3ml，用比色法測定血清CK 和LDH，用ELISA 法測cTnI活性。取心尖部心肌組織，10% 甲醛液固定，石蠟包埋，后在光鏡下觀察心肌損害程度。結(jié)果 IMD 組與I/R 組比較，P <0.01 ； Gli+IMD 組與I/R 組、IMD組比較，P <0.05。結(jié)論 IMD在心血管系統(tǒng)中具有保護(hù)作用且其機(jī)制可能與其激活了ATP敏感性鉀通道相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】ATP 敏感性鉀通道；缺血再灌注；IMD；心肌保護(hù) doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.22.0010
【中圖分類號(hào)】R364.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-5552(2011)22-0021-02


缺血性心臟病(IHD) 已成為西方國家人口死亡的重要原因， 在我國已經(jīng)上升至人口死亡原因的第二位[1]。關(guān)于IHD 的治療首先是恢復(fù)血液灌注，其目的在于解除組織的缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足的狀態(tài)，以阻止缺血性損傷的發(fā)展或促使其恢復(fù)[2]。在對(duì)缺血再灌注(Ischemia-reperfusion injury I/R) 損傷的機(jī)制研究中，中介素(Intermedin IMD) 也稱腎上腺髓質(zhì)素2(ADM-2)，是 2003 年至今新近確認(rèn)的降鈣素基因相關(guān)肽超家族成員，廣泛表達(dá)于嚙齒類動(dòng)物大腦、垂體、腎臟、心臟、肺臟、胃腸道、卵巢，血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]。IMD 同家族成員如ADM和CGRP具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)多個(gè)器官系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，已被諸多文獻(xiàn)證實(shí)具有很強(qiáng)的心血管保護(hù)作用。IMD 是一種新的內(nèi)源性抗損傷保護(hù)物質(zhì)，可能作為心血管疾病防治的新靶點(diǎn)[4,5]。因此，IMD 在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用雄性SD大鼠45 只，體重240-300g( 由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，在常規(guī)條件下飼養(yǎng)，普通飲食，自由飲水。
1.2藥品、試劑和儀器
IMD( 美國Phoenix 公司)、格列本脲( 上海研域化學(xué)試劑有限公司)，cTnI 試劑盒(Biosource 公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK) 試劑盒( 上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司) ；微型動(dòng)物呼吸機(jī)( 浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實(shí)驗(yàn)廠) ；心電圖機(jī)( 上海奧爾科特生物科技有限公司)。
1.3I/R 模型的制備
大鼠稱重后以20% 烏拉坦溶液(4ml/kg) 腹腔注射麻醉，仰臥固定，將心電圖針狀電極插入大鼠四肢皮下，描記肢體Ⅱ?qū)��?lián)心電圖。常規(guī)左側(cè)胸前區(qū)備皮，頸正中切開皮膚，鈍性分離頸前肌，氣管切開置管，連接微型動(dòng)物呼吸機(jī)控制呼吸 ；分離出右頸總動(dòng)脈，用于插管采集血液樣本。沿胸骨左緣第4、5 肋間順勢剪開心包，充分暴露心臟及左心室表面血管，以左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD) 為標(biāo)志，在左心耳根部下方0.3-0.4cm 處進(jìn)針，6/0 絲線( 結(jié)扎線) 穿過心肌組織在肺動(dòng)脈圓錐旁出針，結(jié)扎線兩端分別套入絲線環(huán)作為再灌注拉線，收緊結(jié)扎線使左冠脈前降支閉塞30min，以造成心肌缺血。成功標(biāo)志為 ：心電圖ST 段弓背向上抬


作者單位：030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心胸外科
作者簡介：衛(wèi)雷(1985-)，男，碩士學(xué)歷。Email：ownfight@163.com通訊作者：馬捷

高和結(jié)扎線以下血管支配區(qū)表面顏色由正常變蒼白再變青紫示為心肌缺血。牽拉再灌注拉線使結(jié)扎線放松后恢復(fù)血流即行再灌注2h，造成I/R 模型。
1.4分組及給藥方法
大鼠分組 ：缺血再灌注組、IMD 治療組、格列本脲+IMD 治療組三組。試驗(yàn)給藥 ：(I/R) 組即MI 后5min靜滴生理鹽水至實(shí)驗(yàn)結(jié)束 ；(IMD組)即MI后5min 給予IMD 0.1nmol/kg，加入生理鹽水250ml靜滴至實(shí)驗(yàn)結(jié)束 ；(Gli+IMD組)即MI后5min 給予IMD 0.1nmol/kg 加入生理鹽水250ml同時(shí)加入格列本脲10μmol/L 靜滴至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。給藥滴速均控制在0.5ml/min。
1.5檢測及觀察
各組在造模時(shí)分別抽取動(dòng)脈血3ml至于抗凝離心管中，用2000r/min 離心10min，取上清液，用ELISA 法測cTnI，用比色法測定血清CK 和LDH 活性。
心肌HE病理組織學(xué)染色 ：實(shí)驗(yàn)完畢后取心尖部約100mg 心肌組織，吸水紙脫水固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，從各組中取10 張石蠟切片，二甲苯透明處理，免疫組化HE 染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，P <0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果
2.1各組血清心肌酶比較
與I/R組比較，IMD 組的cTnI、LDH、CK 均下降(P <0.01)； 與IMD組比較，Gli+IMD 組的cTnI、LDH、CK均升高(P <0.05)。見表1：


組別 n LDH(U/L) CK(U/L) cTnI(μg/L) I/R 組 15 982.56±83.24 96.16±8.74 1246.06±82.74
IMD 組 15 456.60±54.32▲ 60.32±5.51▲ 879.09±53.20▲
Gli+IMD 組 15 678.33±34.51★ 79.59±6.50★ 1038.05±63.65★
IMD 組與I/R 組比較，各指標(biāo)▲ P <0.01 ； Gli+IMD 組與I/R 組比較，各指標(biāo)★
P <0.05；Gli+IMD 組與IMD 組比較，★ P <0.05

2.2各組心肌形態(tài)學(xué)改變
光鏡下I/R組主要表現(xiàn)為胞漿嗜酸性變性，可見廣泛大面積呈紅染，心肌橫紋不清甚至消失，心肌纖維呈波浪狀或斷裂融合，

22 基礎(chǔ)研究 中國醫(yī)療前沿 2011年11月 第6卷 第22期 National Medical Frontiers of China, Nov.2011, Vol.6 No.22


肌漿多為不規(guī)則粗顆粒，有明顯細(xì)胞壞死表現(xiàn)，間質(zhì)可見充血、水腫、出血以及嗜中性粒細(xì)胞浸潤 ；IMD 組心肌組織細(xì)胞胞核大小分布均勻, 胞漿嗜酸性變，心肌纖維輕度拉長、變細(xì)，偶見成纖維細(xì)胞及炎細(xì)胞浸潤 ；Gli+IMD 組心肌纖維拉長明顯，心肌纖維呈波浪狀、排列紊亂不規(guī)則，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤。

3討論
IMD 抑制I/R 損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，自由基生成增多和細(xì)胞內(nèi)鈣超載是I/R損傷發(fā)病的主要機(jī)制[6]，文獻(xiàn)報(bào)道ADM可通過抑制氧化應(yīng)激和降低鈣超載以拮抗心肌I/R損傷且實(shí)驗(yàn)觀察到IMD1-53 再灌注具有與ADM相似的減少缺血心肌脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物生成的效應(yīng)[7,8]。研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠左心室IMDmRNA 表達(dá)明顯升高，推測IMD 的表達(dá)增高是由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致[9]。
ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel， KATP) 是受細(xì)胞內(nèi)ATP 濃度調(diào)控的一種內(nèi)向整流鉀通道，正常情況下處于關(guān)閉狀態(tài)，在組織缺血、缺氧或能量耗竭時(shí)被大量激活。近年來研究發(fā)現(xiàn)，KATP 通道的激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞缺血、缺氧反應(yīng)，介導(dǎo)并參與細(xì)胞或組織器官的保護(hù)作用，它可能是心肌保護(hù)效應(yīng)的一個(gè)共同通路、啟動(dòng)因子或終末效應(yīng)器，KATP 的開放能減少線粒體內(nèi)鈣釋放、維持缺血/ 低氧后線體粒的穩(wěn)定性，延緩或減輕缺血/ 低氧后的細(xì)胞凋亡[10]。
宋君秋等[11] 研究表明IMD具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與增加抗凋亡蛋白表達(dá)和降低氧化應(yīng)激損傷減少線粒體釋放細(xì)胞色素C到胞漿，抑制線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。齊永芬[12] 通過試驗(yàn)總結(jié)出IMD通過抑制ERS和氧化應(yīng)激改善心肌I/R 損傷。綜上諸多研究發(fā)現(xiàn)，IMD 在保護(hù)細(xì)胞損傷、抑制凋亡、減輕氧化應(yīng)激等方面有著突出的優(yōu)勢。研究證實(shí)， IMD可通過減少局部活性氧(ROS) 的含量減輕心臟缺血再灌注損傷[13]。IMD 通過G蛋白的介導(dǎo)對(duì)門控K+ 通道進(jìn)行調(diào)節(jié)，也是其發(fā)揮效應(yīng)的一種方式[14]。這在IMD 的擴(kuò)血管及調(diào)節(jié)心肌收縮等方面有重要作用。
研究通過對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷造模觀察心肌肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH) 及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)，檢測三組血清心肌損傷指標(biāo)含量評(píng)定心肌缺血損傷的程度。結(jié)果顯示，在IMD 干預(yù)后，IMD 組較I/R 組的CK、LDH 及cTnI 含量降低，鏡下心肌壞死的損傷病變輕微，提示IMD 可減輕心肌細(xì)胞的I/R 性損傷，證實(shí)其具有心肌保護(hù)效應(yīng)。同時(shí)用格列苯脲+IMD 干預(yù)I/R，結(jié)果顯示Gli+IMD 組較IMD 組的LDH、CK 及cTnI 血清含量升高，鏡下心肌壞死較為明顯，提示格列苯脲取消了IMD 的保護(hù)作用，進(jìn)一步表明心肌KATP 通道參與了IMD 的心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，為臨床研究心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用機(jī)制提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，研究還提示， Gli+IMD 組較I/R 組的LDH、CK 及cTnI 血清含量降低，說明格列苯脲雖然一定程度上阻斷了IMD 對(duì)I/R 心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，但其心肌保護(hù)作用并沒有完全被阻斷，表明IMD 對(duì)I/R 心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)可能還存在其它機(jī)制，諸如通過激活其受體系統(tǒng)和cAMP、NO 途徑等發(fā)揮作用[15]，還有待進(jìn)一步深入研究。
可見，IMD在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中對(duì)參與激活A(yù)TP 敏感性鉀通道有一定的關(guān)聯(lián)，它具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，深入研究對(duì)于防治心血管疾病具有重要意義。

參考文獻(xiàn)
[1]杜秋香. 研究其相關(guān)離子機(jī)制Intermedin 心血管保護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D]. 山西醫(yī)科大學(xué),2011.
[2]Wan-Xing Zhang, Li-Fang Zhou, Lei Zhang, et al . Protective effects of glutamine preconditioning on ischemia- reperfusion injury in rats[J].Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International,2010,2,15(10):78-82.
[3]Morimoto R, Satoh F, Murakami O, et al . Expression of adrenomedullin 2/intermedin in human adrenal tumors ａnd attached non-neoplastic adrenal tissues[J].Endocrinol,2008,198(1):175-183.
[4]吳凱, 王斯, 陳曉平, 等. 中介素在心血管系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 華西醫(yī)學(xué),2011,26(8):1250-1255.
[5]Roh J, Chang CL, Bhalla A, et al . Intermedin is a calcitonin/calcitonin gene-related peptide family peptide acting through the calcitonin receptor-like receptor/receptor activity- modifying protein receptor complexes[J].Biol Chem,2004,279(8): 7264-7274.
[6]Pan CS, Yang JH, Cai DY, et al. Cardiovascular effects of newly discovered peptide intermedin/adrenomedullin[J].Peptides,20 05,26(9):1640-1646.
[7]IE Li-Jun, ZHAO Song, ZHANG Jian-Xin, et al. Propofol protects hearts from ischemia-reperfusion injury through interfering with mitochondria-dependent apoptotic pathway[J]. Chin Pharmacol Bull,2007,21(4):247-254.
[8]Chao J, Chao L.The Role of Adrenomedullin in Cardiovascular ａnd Renal Function[J].Drug News Perspect,2002,15(8):511-518. [9]David Bell, YouYou Zhao, Francis PG, et al . Differential effects of an anti-oxidant intervention on cardiomyocyte expression of adrenomedullin ａnd intermedin ａnd their receptor components in chronic nitric oxide deficiency[J].Cell Physiol Bioc hem,2007,20(5):269-282.
[10]Jens Jung Nielsen, Michael Kristensen, Ylva Hellsten, et al. Localization ａnd function of ATP-sensitive potassium channels in human skeletal muscle[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2003,284(2):R558-563.
[11]宋君秋, 滕旭, 蔡嫣,等.IMD抗大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡與抑制心肌線粒體釋放細(xì)胞素c有關(guān)[G] 心臟研究會(huì)(ISHR) 中國分會(huì)第十屆暨中國病理生理學(xué)會(huì)心血管專業(yè)委員會(huì)第十三屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要文集,2008:73.
[12]齊永芬.Intermedin 抑制心肌缺血/ 再灌注損傷機(jī)制研究[J]. 中國病理生理雜志,2010,26(10):1977-1978.
[13]Yang JH, Jia YX, Pan CS, et al. Effects of intermedin(1-53) on cardiac function ａnd ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,327(3):713-719. [14]Poyner DR, Sexton PM, Marshall I, et al . International Union of Pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin, ａnd calcitonin receptors[J].Pharmacol Rev,2002,54(2):233-246.
[15]Smith RS Jr, Gao L, Bledsoe G, et al . Intermedin is a new angiogenic growth factor[J].Am J Physiol Heart Circ Physio1,2009,297(3):H1040-1047.
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