一、實驗目的

1、深入了解elisa法測定抗體效價的原理。

2、掌握ELISA法測定單克隆抗體效價的方法。

間接ELISA效價圖

二、實驗原理

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標記在抗體/抗原分子上，形成酶標抗體/酶標抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板（或球）吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應后都要反復洗滌，這既保證了反應的定量關(guān)系，也避免了末反應的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中。酶促反應只進行一次，而抗原、抗體的免疫反應可進行一次或數(shù)次，即可用二抗（抗抗體）、三抗再次進行免疫反應。

目前常用的幾種ELISA方法有：測定抗體的間接法，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內(nèi)，加待測抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，加酶標抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應，用目測或光電比色測定抗體含量。

三、儀器、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。

原料

單克隆抗體

試劑

1、抗原及酶標記抗體

①抗原：兔抗人IgG（RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423）;

②酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP（RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260）;均為DAKO公司產(chǎn)品，使用時按照說明書要求稀釋。

4、洗滌液（含0.05%Tween20的PBS）：1LPBS中加入Tween-20500μL.

5、封閉液（含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween20的PBS）：10mLPBS中加入100mgBSA，10μLTween-20.

6、底物溶液

①磷酸鈉鹽緩沖液（0.1mol/LpH6.0）：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL.

②TMB貯液：稱60mgTMB溶于10mL二甲基亞砜中，4℃避光保存。

③底物應用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB貯液10μL.30%H2O215μL，混勻。

7、終止液：2mol/LH2SO4

四、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板

中。4℃放置過夜。

②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h.

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品（一抗）：將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS連續(xù)稀釋（按照1：2或1：10），100μL/孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS或空白培養(yǎng)基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h.

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。

⑩終止反應、比色：加50μL/孔終止液。顏色變黃;用酶標儀測定450nm處各孔的吸光值，陽性反應的稀釋度為待測樣品的效價。

原創(chuàng)作者：上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司