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點擊次數(shù)：15917 發(fā)布時間：2013/9/22 17:00:50
紙層析法是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定。本文主要介紹了紙層析法分離鑒定氨基酸的實驗原理、器材和具體操作步驟。
紙層析法
一、目的
通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作方法。
二、原理
紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。
層析溶劑由有機溶劑和水組成。
物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf 值（比移）來表示的：
R=原點到層析點中心的距離
原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf 值是常數(shù)。Rf 值的大小與物質(zhì)的結構、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。
三、器材
1、層析缸① 2、毛細管3、噴霧器4、培養(yǎng)皿
5、層析濾紙（新華一號）
四、試劑
1、擴展劑
是4 份水飽和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。將20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，與15mL 水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴展劑約5mL 置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養(yǎng)皿中備用.
2、氨基酸溶液0.5%的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組份濃度均為0.5%）。各5mL
3、顯色劑50~100mL
0.1%水合茚三銅正丁醇容液。
五、操作
1、將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。
2、取層析濾紙（長22cm、寬14cm）一張。在紙的一端距邊緣2~3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上第間隔2cm 作一記號如右圖。
3、點樣用毛細管將各種氨基酸樣品分別點在這6 個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑不超過3mm。
4、擴展用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴展劑的培養(yǎng)皿建迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需你于點樣線1cm）。待溶劑上升15~20cm 時即取出濾紙，自然干燥或用吹風機熱風吹干。
5、顯色用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5 分鐘（100℃）或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。
6、計算各種氨基酸的Rf 值。
原創(chuàng)作者：上海恒遠生物技術發(fā)展有限公司
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