激酶活性分析

蛋白激酶通常是多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的常見(jiàn)組分，它們影響了眾多負(fù)責(zé)生物反應(yīng)的下游效應(yīng)物，因此，評(píng)估某個(gè)特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性通常是在體外測(cè)定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過(guò)一些報(bào)告系統(tǒng)來(lái)評(píng)估特定激酶對(duì)底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測(cè)。此外，R&D Systems還提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能夠定量任何可產(chǎn)生ADP的激酶的活性。盡管我們能夠獲得有關(guān)特定激酶行為的信息，但評(píng)估細(xì)胞提取物中的酶活性僅僅揭開(kāi)了信號(hào)通路的冰山一角。我們對(duì)蛋白如何被修飾還知之甚少，且體外活性分析也不能說(shuō)明內(nèi)源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測(cè)可能為細(xì)胞如何應(yīng)對(duì)外界刺激提供更詳細(xì)的分析，因?yàn)榱姿峄�肽段的鑒定為蛋白的表達(dá)和功能狀態(tài)提供信息。

酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）

ELISA已逐漸成為測(cè)定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優(yōu)于Western blot，且在調(diào)節(jié)激酶活性和功能的研究中表現(xiàn)出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復(fù)雜的異質(zhì)樣品（如細(xì)胞裂解液）中的一個(gè)組分。加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測(cè)抗體。這些分析通常設(shè)計(jì)為顯色或熒光檢測(cè)。產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與*初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統(tǒng)的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術(shù)具有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，利用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)品，可輕松定量結(jié)果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個(gè)抗體，帶來(lái)了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測(cè)低豐度的蛋白。*后，微孔板形式的通量比傳統(tǒng)的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來(lái)了激酶活性的間接測(cè)定。不過(guò)，另一類ELISA技術(shù)使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測(cè)方法，帶來(lái)激酶活性的更直接測(cè)定。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司